Dedicou-se à clínica psiquiátrica a partir de então (1882), em intensa colaboração com Josef Breuer, que criara o método catártico e descobrira a íntima relação existente entre os sintomas histéricos e certos traumas de infância (1882-1896). Sentindo as limitações de Viena no tocante às possibilidades de aperfeiçoamento, planejou uma viagem a Paris a fim de assistir aos cursos proferidos por Jean-Martin Charcot. Para tanto, dispôs-se a obter o mestrado em neuropatologia e ganhou bolsa para um período de especialização em Paris (1885).
Ainda em Paris, concebeu o plano de um trabalho destinado a estabelecer uma distinção entre as paralisias orgânicas e as paralisias histéricas. Desenvolveu também profundos estudos sobre sintomas de histeria e, publicou no período, em colaboração, dois trabalhos, dos quais o mais célebre é Studien über Hysterie (1895), que marca o início de suas investigações psicanalíticas. Após romper com Breuer, substituiu a hipnose pelo processo da livre associação de idéias, o que lhe permitiu isolar e estudar os fenômenos de resistência e de transferência. A tese de Charcot, de que a histeria não era uma doença mental exclusiva da mulher, foi inteiramente absorvida por ele, o que lhe valeu violentas críticas dos meios acadêmicos de Viena, tão logo a expôs por ocasião de seu regresso.
Suas teorias inicialmente não foram bem recebidas, porém se tornaram profundamente influentes a partir do século vinte. Passou a observar a natureza sexual dos traumas infantis causadores das neuroses (1897) e começou a delinear a teoria do chamado complexo de Édipo, segundo o qual seria parte da estrutura mental dos homens o amor físico pela mãe e o ímpeto de assassinar o pai. O médico vienense tornou o ano inicial do século o ano oficial do lançamento de sua primeira obra psicanalítica propriamente dita, Die traumdeutung (1900), de fato lançada um ano antes.
Fundou a Sociedade Psicanalítica de Viena (1908), realizou o primeiro congresso de psicanálise em Salzburg, onde se decidiu a publicação de um anuário dirigido por ele e Bleuler, cujo redator-chefe era Jung. Pronunciou um ciclo de conferências nos Estados Unidos (1909), a convite da Clark University, em Worcester, fato que representou a primeira aceitação oficial da psicanálise, participou por ocasião do segundo congresso internacional de psicanálise, realizado em Nuremberg (1910), da fundação da Associação Psicanalítica Internacional, que congregou os psicanalistas de todo o mundo.
Com o agravamento da pressão nazista e com à ajuda financeira de Marie Bonaparte, mudou-se para Londres, onde ficou até sua morte. Trabalhava a esse tempo, em colaboração com sua filha Anna, na redação de uma obra dedicada à análise da personalidade de Hitler. Outras de suas obras destaque são Die Traumdeutung (1900), Zur Psychopathologie des Alltagslebens (1904) e Drei Abhandlungen zur Sexualtheorie (1905), Totem und Tabu (1913), Das Unbehagen in der Kultur (1930), e Der Mann Moses und die monotheistiche Religion (1939).